Een initiatief van :



Stichting Food-Info



Food-Info.net> Onderwerpen > Literatuurverslagen

De rol van melkzuurbacteriën in het rijpen van kaas

Mirjana Eimermann
Levensmiddelentechnologie
Wageningen Universiteit


INHOUDSOPGAVE



SAMENVATTING i

VOORWOORD ii

1. INLEIDING 1
1.1 Het rijpen van kaas: De processen en bijbehorende rijpingsenzymen 1
1.1.1 De processen 1
1.1.2 Rijpingsenzymen 1
1.2 Rijpingsduur 2
1.3 Fysiologie van melkzuurbacteriën 2

2. DE OPBOUW VAN MELKZUURBACTERIEN 3
2.1 Autolyse van de celwand van melkzuurbacteriën 3
2.2 Celwand van melkzuurbacteriën 3
2.3 Osmotische druk 3

3. FACTOREN VAN INVLOED OP DE AUTOLYSE SNELHEID VAN MELKZUURBACTERIEN IN KAAS
3.1 Invloed van de stam 5
3.2 Invloed van de rijpingstemperatuur 6
3.3 Invloed van de pH 6
3.4 Invloed van de zoutconentratie 6

4. DISCUSSIE EN TOEKOMSTPERSPECTIEF 7

LITERATUURVERWIJZINGEN 14

SAMENVATTING


Het rijpen van kaas vindt plaats in de tijd tussen het opslaan van de verpakte kaas en de consumptie van de kaas door de consument. Dit is een lange tijd, waardoor de opslagkosten van de kaas hoog oplopen. Hierdoor is reeds decennia lang interesse naar het ontwikkelen van methoden die deze tijd doen verkorten. Allereerst is het nodig om meer inzicht in het kaasrijpen te krijgen.
Tijdens het rijpen treden drie biochemische processen op, namelijk: Proteolyse, lipolyse en glycolyse. De proteolytische reacties lijken de voornaamsten te zijn, aangezien ze bijdragen aan het vormen van zowel de textuur als het aroma.
Bij het maken van kaas wordt de melk aangeënd met een mengsel van melkzuurbacteriën. Deze melkzuurbacteriën zijn onder andere nodig om de textuur- en de aromavorming te doen plaatsvinden. Melkzuurbacteriën beschikken over een complex proteolytisch systeem waarmee eiwitten uit de melk afgebroken worden tot aminozuren. Deze aminozuren kunnen hierna verscheidene modificatie reacties ondergaan. De afbraak van eiwitten veroorzaakt textuur veranderingen; Aminozuren en producten uit modificatie reacties leveren aromacomponenten.
Gedurende het rijpen zijn de starter melkzuurbacteriën inactief. Toch gaat het vormen van aminozuren en afbraakcomponenten door. De enige mogelijkheid is dan uitlek van de rijpingsenzymen van de starters naar de kaasmatrix via autolyse van de celwand. Autolyse is het spontaan uiteenvallen van de celwand van een bacterie. De celwand van een bacterie beschermt de celmembraan en de inhoud van de cel. Wanneer de celwand wordt afgebroken en een osmotisch drukverschil tussen het milieu in de cellen en de kaasmatrix heerst, kan de celmembraan gemakkelijk beschadigt raken. In dat geval kan contact gemaakt worden tussen componenten die zich in de cellen bevinden en componenten die zich in de kaasmatrix bevinden. Autolyse lijk een belangrijke rol te hebben in het ontstaan van aminozuren gedurende het rijpen van de kaas. En dus lijkt de snelheid hiervan de snelheid van het rijpen te beïnvloeden. De snelheid van de autolyse wordt onder andere beïnvloed door de stam van de betreffende melkzuurbacterie, de temperatuur, pH en de aanwezigheid van zoutionen gedurende het rijpen.
Het is een belangrijke vraag of de rijpingsenzymen die naar de kaasmatrix zijn uitgelekt lang genoeg stabiel blijven. Tot korte tijd geleden bestond de veronderstelling dat intracellulaire rijpingsenzymen enkel in aanraking konden komen met het extracellulaire subtraat na het vrijkomen van deze enzymen in de kaasmatrix. Deze visie is sinds kort echter herzien: Er wordt nu verondersteld dat autolyse van de celwand tot twee situaties kan leiden: Het kan leiden tot uitlek van de celinhoud in de kaasmatrix, òf tot het diffunderen van de peptiden uit de kaasmatrix naar de cel. Het vermoeden bestaat dat de tweede situatie een grotere bijdrage zal leveren aan het rijpen in verband met een grotere stabiliteit van de rijpingsenzymen.
Niet enkel de cellen waarvan de celwand gelyseerd is dragen bij aan de vorming van het kaasaroma. Aromacomponenten die via modificatiereacties uit aminozuren ontstaan, kunnen enkel door intacte cellen gevormd worden. De correcte balans tussen het ontstaan van aminozuren en modificatie producten zal per type kaas verschillen.
Met deze nieuwe inzichten is de optimalisatie van de stammen en methoden, die het rijpen aanzienlijk kunnen verkorten en het waarborgen van de kwaliteit beter kunnen waarmaken, wellicht een stukje dichterbij gekomen. Niettemin blijft verder onderzoek noodzakelijk.

VOORWOORD


Toen ik een klein jaar geleden met het vak ‘Literatuuronderzoek en schriftelijk rapporteren' begon, keek ik eigenlijk best wel op tegen het schrijven van de scriptie. Dit kwam voornamelijk doordat ik de bijbehorende ‘literatuurrecherche' nauwelijks bij deze scriptie kon gebruiken. Daarnaast ontbrak het me steeds aan de tijd die ik nodig had om me goed in het onderwerp te kunnen verdiepen.
Bijna een jaar later ben ik er eindelijk in geslaagd om tijd voor m'n scriptie vrij te maken en ik moet eerlijk zeggen dat het me voor 100% meegegevallen is. Dit komt mede doordat mijn begeleidster, Vesna Prsiç, gerichte antwoorden op mijn vragen heeft gegeven en me ook duidelijk de goede richting heeft gewezen. Ik wil haar hierbij dan ook voor haar hulp bedanken.
Tot slot wil ik zeggen dat ik het rijpen van kaas een ingewikkeld, maar interessant onderwerp vind.

Mirjana Eimermann,
Oktober 1998.

1. INLEIDING



1.1 Het rijpen van kaas: De processen en bijbehorende rijpingsenzymen

1.1.1 De processen

Een gerijpte kaas, die in schappen van de winkel ligt, heeft reeds drie verschillende stadia doorgemaakt namelijk: Het maken van de kaas, de primaire rijping en de secundaire rijping (Crow et al ., 1993).
Het maken van een kaas begint met het beënten van melk met een bepaald mengsel van melkzuurbacteriën. Dit mengsel bevat voornamelijk starter melkzuurbacteriën (zogenaamde SLAB). Daarnaast komen geringere aantallen niet-starter melkzuurbacteriën (zogenaamde NSLAB) en starter adjuncts voor. De melksuiker lactose wordt gefermenteerd tot melkzuur. Na toevoegen van stremsel coaguleert het melkeiwit caseïne. Het onstane gel krijgt na het snijden met behulp van messen de naam wrongel. Alvorens deze wrongel wordt verpakt, opgeslagen en het rijpen kan beginnen, wordt de wrongel nog ingezout en samengeperst (Crow et al ., 1993). De twee rijpingsfasen doen hun intrede nadat de verzuurde wrongel verpakt is. Tijdens de primaire rijping hydrolyseren de eiwitten en de polypeptiden uit de wrongel tot kleinere peptiden en aminozuren. De vetten hydrolyseren tot vrije vetzuren en glycerol. Deze hydrolyse eracties zorgen voornamelijk voor het ontstaan van van aroma's en textuurveranderingen. In de secudaire rijpingsfase vinden onder andere modificaties van aminozuren en vrije vetzuren plaats. Deze hebben vooral invloed op de verdere aromavorming (Crow et al ., 1993).

1.1.2 Rijpingsenzymen

Zoals in paragraaf 1.1.1 vermeld is, bestaat de kaasrijping uit proteolyse, lipolyse en glycolyse. Deze drie biochemische processen worden veroorzaakt door enzymen. Enzymen die de proteolyse verzorgen zijn afkomstig van zowel starter als niet-starter melkzuurbacteriën (de zogenaamde SLAB en NSLAB), het overgebleven stremsel en het plasmine uit de melk.
De lipolyse wordt verzorgd door lipasen en esterasen van de SLAB en de NSLAB (El Soda et al ., 1995). Hoewel de lipolyse in minder sterke mate optreedt dan de twee andere biochemische processen, is dit proces wel belangrijk voor het rijpen: De lipolytische producten hebben namelijk geur-drempelwaarden (Crow et al ., 1993).
De glycolyse treedt voornamelijk vóór het rijpen op: De starters (de SLAB) zorgen dat lactose snel genoeg gefermenteerd wordt tot melkzuur. Dit is belangrijk, omdat het gevormde melkzuur een pH-verlaging teweeg brengt, die bederf veroorzakende micro-organismen minder kans geeft uit te groeien. Tevens worden er gunstige omstandigheden gecreeërd voor andere enzymatische reacties (El Soda et al ., 1995). De rol van de SLAB vóór het rijpen is vrij goed bekend. Dit is in tegenstelling tot de rol binnen het rijpingproces (Crow et al ., 1993). Uit bovenstaande gegevens blijkt echter wel dat de LAB belangrijk zijn voor het rijpen van kaas.
De proteolytische reacties zijn de belangrijkste processen van de kaasrijping (Crow et al ., 1995, Fox et al ., 1996). Stremsel en plasmine hydrolyseren caseïne tot lang- en kortketenige peptiden, die door proteolytische enzymen van de SLAB en de NSLAB verder worden afgebroken. Verscheidene studies hebben een positieve correlatie aangetoond tussen de concentratie vrije aminozuren en de intensiteit van het kaasaroma (El Soda et al ., 1995). In 1997 heeft Visser een poging gedaan om Goudse kaas te maken zonder het toevoegen van een startercultuur. De kaas miste de karakteristieke geur en textuur (Youssef, 1992). Deze resultaten geven het belang van de LAB in de aroma en textuur ontwikkeling aan (El Soda et al ., 1995). Om deze reden zal in het verloop van dit verslag de rol van de LAB binnen de proteolyse, en hiemee tevens binnen de kaasrijping, nader worden toegelicht.

1.2 Rijpingsduur

De lengte van de rijpingsduur is afhankelijk van het type kaas en varieert van een antal weken tot een jaar (Baankreis, 1992). De opslagkosten voor alle Nederlandse kazen in pakhuizen bedragen wekelijks 21 miljoen gulden (Jaeger, de, 1998). De lange opslagtijd zorgt dus voor hoge kosten. Het is niet verwonderlijk dat er onderzoek verricht wordt naar methoden die in staat zijn dit proces te verkorten. Pas wanneer meer inzicht bestaat in de processen die zich gedurende de kaasrijping voordoen, kunnen er serieuze pogingen gedaan worden om deze processen te optimaliseren.

1.3 Fysiologie van melkzuurbacteriën

Er zijn drie groepen melkzuurbacteriën bij het kaasrijpen betrokken: De starters (de zgn. SLAB); de niet-starters (de zg. NSLAB) en de starter adjuncts.
De SLAB, waaronder zich zowel thermofielen als mesofielen bevinden, hebben een belangrijk aandeel in de zuurvorming en de biomassa van de LAB in de jonge wrongel. Ze moeten namelijk in staat zijn om in één dag uit te groeien van de entingsaantallen van 10E6 à 10E7 tot 10E8 à 10E9 cfu's (colony forming units) per gram wrongel. NSLAB zijn na één dag aanwezig in aantallen van ongeveer 10E2 cfu's per gram wrongel en bereiken in het verloop van de rijping het stabiele aantal van 10E7 cfu's per gram kaas (Crow et al ., 1995). De NSLAB kunnen vanaf dat moment in dezelfde mate bijdragen aan de kaasrijping als de SLAB (Crow et al ., 1993). De aantallen starter adjuncts zijn na één dag gewoonlijk kleiner dan 10E6 cfu per gram kaas, waardoor ze nauwelijks aan de zuurvorming bijdragen. Ze leveren waarschijnlijk wel een bijdrage aan de vorming van het aroma (Crow et al ., 1995).

De melkzuurbacteriën vertonen dit aantallen-verloop dankzij hun fysiologisch systeem: Melkzuurbacteriëren kunnen slechts in een rijk medium groeien, aangezien ze vele essentiële aminozuren en vitaminen niet zelf aanmaken (Marshall and Law, 1984). Dankzij deze reden komen LAB slechts in rijke media als melk voor. Het melkeiwit bevat de meeste essentiële aminozuren, maar deze komen niet in vrije vorm voor: De LAB zullen de aminozuren dan ook zelf vrij moeten maken uit het aanwezige melkeiwit. Hiervoor hebben de LAB de beschikking over een ingewikkeld proteïnase en peptidasen complex, waarmee ze het eiwit afbreken tot peptiden, die vervolgens afgebroken worden tot aminozuren. De extracellulaire celwand-gebonden proteïnase breekt als eerste de melkeiwitten af tot oligopeptiden, die via een oligopeptide transportsysteem in de cel gebracht worden, waarna de intracellulaire peptidasen deze peptiden afbreken tot aminozuren (Meijer, 1997).

2. DE OPBOUW VAN MELKZUURBACTERIEN



2.1 Autolyse van de celwand van melkzuurbacteriën

Autolyse is het spontaan uiteenvallen van de celwand van een bacterie door het activeren van autolysinen. Dit zijn celeigen enzymen. Een voorbeeld is lysozym (El Soda et al ., 1995). Deze enzymen kunnen in twee verschillende situaties geactiveerd worden: In de exponentiële groeifase van de cel kunnen de autolysinen helpen bij de celdeling. De expressie van autolysinen is dan nauwkeurig gereguleerd: De celwand van de bacterie lyseert, zodat uit één cel twee nieuwe cellen kunnen ontstaan (Crow et al ., 1995, Meijer, 1997). Daarnaast kunnen de autolysinen een rol spelen tijdens de stationaire groeifase van de bacterie: Dit gebeurt bijvoorbeeld als het medium waarin de cel zich bevindt niet (langer) aan de voedingseisen van de cel kan voldoen.
Tijdens de rijping van de kaas raken de LAB door de snelle lactose fermentatie hun koolstofbron kwijt en worden hierdoor metabolisch inactief. Dit sluit actief transport van de extracellulaire oligopeptiden naar de intracellulaire peptidasen uit. Om de vorming van aminozuren te bewerkstelligen is daarom uitlek van de peptiden in de kaasmatrix, via lysis van de LAB, noodzakelijk. In kaas speelt de autolyse van de LAB dus een rol via de stationaire groeifase (Meijer, 1997).

2.2 Celwand van melkzuurbacteriën

Het cytoplasma van de cellen van de LAB is omgeven door een celmembraan. Om deze celmembraan zit een celwand die uit een peptidoglucaanlaag is opgebouwd. De celwand vormt een barrière tussen de intra- en de extracellulaire ruimte (Meijer, 1997). Een intacte celwand verhindert de uitwisseling van stoffen tussen de intra- en de extracellulaire ruimte, die zich in afwezigheid van de celwand zou voordoen zolang er geen thermodynamisch evenwicht zou zijn. Het milieu binnenin de cel kan op deze manier verschilen van het milieu buiten de cel (Crow et al ., 1993).
Als een cel autolyseert gaat deze barrière verloren. Het is duidelijk dat een cel met een intacte celwand zich in een andere fysiologische staat bevindt dan een gelyseerde cel (Crow et al., 1993) en dat een verschil tussen de osmotische druk in de cel en erbuiten een grote invloed kan hebben op een gelyseerde cel (Youssef, 1992).

2.3 Osmotische druk

Een bacteriecel kan zich in drie fysiologische staten bevinden:
Een cel kan voorkomen als intacte, levende cel, met een onbeschadigde celwand en een fuctionerende membraan. Het milieu binnenin deze cel verschilt van het milieu buiten de cel.
Daarnaast bestaan er zogenaamde spheroplasten. Dit zijn cellen waarvan de celwand de integriteit heeft verloren. De celmembraan is echter nog steeds intact. Door het transport van water over de membraan, is de omotische druk aan de binnnen- en buitenkant van de cel gelijk. De inhoud van de cellen lyseert niet (Crow et al ., 1993). De celmembraan van spheroplasten bezit echter niet de bescherming door de celwand, die een levende, intacte cel wel bezit. De celmembraan kan bij gebrek aan deze bescherming beschadigd raken als er een verschil tussen de osmotische druk binnenin en buiten de cel heerst (Youssef, 1992). In dat geval ontstaan gepermeabiliseerde shperoplasten (Crow et al ., 1993). De intracellulaire enzymen kunnen dan op twee manieren in contact komen met het extracellulaire substraat: Na autolyse van de cel kunnen de intracellulaire enzymen in de kaasmatrix vrijkomen, of de peptiden kunnen –in het geval dat de inhoud van de gelyseerde cellen nog niet is leeggelopen- de cel in diffunderen (Youssef, 1992). Welke situatie zich voordoet, hangt af van het soort drukverschil dat over de membraan heerst. In het geval van een hypotonische cel is de druk binnenin de cel groter dan de druk erbuiten. Om het drukverschil op te heffen, zullen water en peptiden van buiten de cel naar binnen diffunderen. Als de druk daarentegen binnenin de cel lager is dan erbuiten, is er sprake van een hypertonische cel. In dat geval zullen water en peptidasenvanuit de intaracellulaire ruimte naar buiten diffunderen.
Hypertonische cellen komen in kaas nauwelijks voor. De meeste cellen zijn isotonisch: Er heerst geen drukverschil over de membraan. Daarnaast kunnen in kaas tevens hypotonische cellen voorkomen.

3. FACTOREN VAN INVLOED OP DE SNELHEID VAN AUTOLYSE VAN MELKZUURBACTERIEN IN KAAS


Zoals in paragraaf 2.1 reeds vermeld is, zijn de LAB tijdens het rijpen van de kaas door het opraken van de koolstofbron metabolisch inactief. Dit sluit actief transport van de extracellulaire oligopeptiden naar de intracellulaire peptidasen uit. Gedurende het rijpen treden echter wel belangrijke proteolytische reacties op, zoals de vorming van aminozuren. Aminozuren hebben een belangrijke bijdrage aan het tot stand komen van het basis aroma van de kaas en kunnen tevens als substraat fungeren voor vele enzymatische reacties. Deze enzymatische reacties zorgen voor belangrijke aromacomponenten, die op hun beurt precursors kunnen zijn voor reacties, die voor een verdere ontwikkeling van het aroma van de kaas zorgen (Crow et al ., 1995).
De LAB die in starterculturen gebruikt worden, bezitten een complex proteolytisch systeem, dat binnen het proces van het maken van een gerijpte kaas twee functies heeft: Het voorziet de cellen van aminozuren die noodzakelijk zijn voor de groei van de cellen. Dit gebeurt via de hydrolyse van peptiden. Daarnaast zijn de peptidasen betrokken bij de ontwikkeling van het aroma van de kaas dat bij het verjaren ontstaat. De laatst genoemde functie treedt op nadat de actieve celgroei is gestopt en de intracellulaire peptidasen in de kaasmatrix zijn vrijgekomen (Niven and Mulholland, 1998).
Aan het begin van de rijpingsperiode worden de gevormde aminozuren voornamelijk door de starters gebruikt, aangezien de NSLAB nog niet tot grote hoeveelheden zijn uitgegroeid. In latere stadia leveren de NSLAB wel een belangrijke bijdrage aan het ontstaan en het verdwijnen van aminozuren (Crow et al ., 1993).
Verschillende starter stammen variëren aanzienlijk in het lysis-verloop (Crow et al ., 1993). Daarnaast wordt de autolyse van starters beïnvloed door het type koolstofbron, de temperatuur, het groeistadium waarin de cellen zich bevinden en toevoegingen van zout of andere kationen (Crow et al ., 1995). Om de precieze invloed van deze factoren vast te kunnen stellen, dienen ze in het kaasmilieu zelf te worden bestudeerd (Crow et al ., 1993). In de komende vier paragrafen worden deze factoren nader toegelicht.

3.1 Invloed van de sta

Om de autolyse snelheid van verschillende stammen met elkaar te vergelijken, kan gebruik gemaakt worden van de concentraties en locaties van de potentiële rijpingsenzymen. L. lactis subs. cremoris lyseert bijvoorbeeld sneller dan L. lactis subs. Lactis. Dit verschil kan waarschijnlijk voor een deel verklaard worden door verschillen in de structuur van het celoppervlak. Zo geeft de proteïnase activiteit die bij intacte cellen gemeten wordt, een indicatie van de activiteit van het celgebonden proteïnase. In het algemeen worden lagere activiteiten gemeten bij stammen die langzamer lyseren. Cellen waarvan de celwand is uitgedund kunnen lyseren als ze in een hypotonische buffer geplaatst worden. Met deze methode kan het worden vastgesteld welk aandeel van de totale proteïnase activiteit afkomstig is van het cel-gebonden proteïnase. De gemiddelde totale proteïnase activiteit is bij verschillende stammen nagenoeg gelijk, maar de activiteit van het cel-gebonden proteïnase is bij langzaam lyserende stammen significant lager dan bij stammen die snel lyseren.
Proteïnasen en esterasen bevinden zich op verschillende plaatsen in de cel en komen in verschillende proporties voor. Deze twee variabelen kunnen per stam verschillen. De relatieve stabiliteit van de rijpingsenzymen is een belangrijke factor bij het bepalen van de eindproducten van de proteolyse en de lipolyse.
De verschillende peptidasen vertonen bij verschillende stammen verschillende activiteiten. Er is echter geen verband tussen de gemeten activiteit en de autolyse snelheid van een stam.
Aangezien de LAB de belangrijkste leveranciers van proteolytische enzymen zijn, die zich bovendien voornamelijk intracellulair bevinden, kan gemakkelijk het idee ontstaan dat de autolyse van de LAB de snelheidsbepalende stap van het kaasrijpen is. Natuurlijk is het niet louter de autolyse snelheid die de rol van van de stam binnen het rijpen van kaas bepaalt. Het is verleidelijk verschillen in de lysis van verschilllende starters en waargenomen aroma verschillen aan elkaar te relateren. Deze relatie zal echter hoogstens van indirecte aard zijn, omdat tevens vele andere factoren die een bijdrage leveren aan de rijping beschouwd dienen te worden. Tussen verschillende lactococcus stammen bestaan aanzienlijke variaties. Deze variaties hebben betrekking op het lytisch vermogen, op zowel de proteïnase, esterase,als de vier peptidasen actvivteiten; en op de relatieve locatie van deze enzymen ten opzichte van elkaar. Deze eigenschappen zijn allemaal factoren, die waarschijnlijk resulteren in het tot stand komen van de rol van een bepaalde stam binnen het proces van het kaasrijpen. Het is erg moeilijk het relatieve belang van deze factoren aan te geven (Crow et al ., 1993).

3.2 Invloed van de temperatuur

De optimale groeitempertuur ligt voor veel LAB rond de 30 of 40°C. Voor een enkele stam ligt deze waarde rond de 50°C. De autolyse van deze LAB verloopt op maximale snelheid rond de optimale groeitemperaturen (El Soda et al ., 1995). Dit is niet verbazingwekkend: De autolyse speelt hier een rol binnen de exponentiële groeifase: namelijk bij de celdeling. En juist bij de optimale groeitemperatuur verloopt de celdeling op maximale snelheid.
Deze temperaturen worden echter niet bij het rijpen van kaas gebruikt. De temperaturen die gebruikt worden zijn afhankelijk van het type kaas en liggen tussen de 4 en 12°C. Alle stammen vertonen bij 12°C een snellere autolyse dan bij 4°C (El Soda et al ., 1995). De autolyse wordt verzorgd door enzymen. Enzymatische reacteis verlopen over het algemeen sneller naarmate de temperatuur hoger is. Dit geldt echter totdat die temperatuur bereikt is, waarbij de enzymen door hitte geïnactiveerd worden.
Daarnaast heeft vriezen ook een effect op de autolyse snelheid: Twee cycli van achtereenvolgens bevriezen en ontdooien zorgen voor een verhoging van de autolyse snelheid, terwijl drie van deze cycli de snelheid juist doen dalen (El Soda et al ., 1995). Waarschijnlijk zijn de autolysinen gedurende de derde maal bevriezen door de kou geïnactiveerd. De eerste twee cycli doen een gestresste situatie ontstaan, waardoor de cellen sneller lyseren. Hier speelt de autolyse dan ook een rol binnen de stationaire groeifase.

3.3 Invloed van de pH

De pH-waarden, waarbij de groei van veel LAB maximaal verloopt, liggen rond pH = 5,5 of 7,5. Bij deze pH-waarden verloopt de autolyse ook op maximale snelheid (El Soda et al ., 1995). De verklaring hiervoor loopt parallel aan de verklaring die voor de optimale groeitemperatuur geldt.

3.4 Invloed van de zoutconcentratie

De cel van een LAB is negatief geladen, waardoor de cel het positief geladen lysozym kan aantrekken. In de afwezigheid van competerende anionen zorgt lysozym voor een snelle hydrolyse van de celwand, maar doordat het de negatieve lading van de cel afschermt, vindt geen lytische reactie plaats. Een plotselinge introductie van NaCl zorgt voor positieve ionen die de beschermingslaag verbreken. Hierdoor gaat de lysis van start (El Soda et al ., 1995). Dit is tevens de situatie die zich bij het maken van de kaas voordoet: Nadat de wrongel reeds 24 uur lang is samengeperst, wordt de wrongel gedurende 120 uur ingezout. Tijdens die eerste 24 uur hebben de SLAB de gelegenheid gekregen om van het entings aantal van 10E6 à 10E7 cfu's per gram wrongel uit te groeien tot 10E8 à 10E9 cfu's per gram wrongel (Baankreis, 1992). Indien het inzouten gelijktijdig met de enting plaats zou vinden, zou de lysis te snel van start gaan en de SLAB niet tot de gewenste aantallen kunnen uitgroeien. Dit zou allerlei negatieve gevolgen hebben voor het rijpingsproces.
De zoutconcentraties die normaliter in kaas worden aangetroffen veroorzaken een toename van de autolyse snelheid (El Soda et al ., 1995).

4. DISCUSSIE EN TOEKOMSTPERSPECTIEF


Uit de voorafgaande hoofdstukken kan geconcludeerd worden dat de LAB bijdragen leveren aan het tot stand komen van gerijpte kaas. Allereerst zorgen ze via de glycolyse voor de gewenste zuurvorming. Daarnaast dragen ze via proteolytische en lipolytische reacties bij aan het ontstaan van de textuur en het aroma van de gerijpte kaas.
LAB kunnen slechts in niet-gelyseerde toestand lactose fermenteren tot melkzuur. De eventueel overgebleven hoeveelheid lactose, zal na lysis van de SLAB dan ook door de intacte NSLAB gefermenteerd worden. Dit zal naar alle waarschijnlijkheid leiden tot variabiliteit van het aroma tijdens het rijpen en het kan tevens leiden tot het ontstaan van off-flavours. Deze gegevens duiden aan dat het waarschijnlijk erg belangrijk is dat genoeg intacte starter cellen in de wrongel aanwezig zijn om de aanwezige hoeveelheid lactose volledig te kunnen fermenteren. Het is niet bekend of een optimale verhouding van het aantal intacte en het aantal gelyseerde cellen bestaat om het rijpen van verschillende soorten kaas naar wens te laten verlopen.
Deze intacte starter cellen zijn niet alleen voor de zuurvorming van belang. In verse wrongel is een mengsel van intacte en gelyseerde starter cellen aanwezig. Tijdens het rijpen treden zowel cofactor-afhankelijke, als cofactor-onafhankelijke reacties op. Intacte starter cellen kunnen cofactor-afhankelijke enzymreacties katalyseren, terwijl gelyseerde cellen slechts cofactor-onafhankelijke reacties kunnen katalyseren.
Proteolytische reacties die door starter enzymen verzorgd worden, verlopen cofactor-onafhankelijk. Veel modificatie reacties van aminozuren zijn daarentegen cofactor-afhankelijk. Aangezien deze modificatie reacties daadwerkelijk tijdens het rijpen optreden, zal de rijpende kaas een mengsel van intacte en gelyseerde starter cellen bevatten. De balans tussen de twee soorten reacties zal bijdragen aan de kwaliteit van de kaas. De correcte balans zal waarschijnlijk voor iedere kaassoort anders zijn. De verhouding van deze aantallen wordt beïnvloed door de gebruikte starter stammen, de condities die tijdens het proces heersen (temperatuur, pH, zoutconcentratie) en de samenstellingen van de melk en de kaas. Al deze factoren zijn gedurende het rijpen aan verandering onderheven (Crow et al ., 1995).
Tijdens het rijpen van de kaas treden belangrijke proteolytische reacties op. Doordat de aantallen levende SLAB te klein zijn om deze reacties te veroorzaken, zijn de gelyseerde SLAB hier waarschijnlijk voor verantwoordelijk. Waarschijnlijk zijn de intracellulaire peptidasen door het lyseren van de cel in de kaasmartix terecht gekomen en veroorzaken hier de proteolytische reacties.
Hieruit kan geconcludeerd worden dat deze enzymen in de kaasmatrix actief blijven. De exacte stabiliteit van deze peptidasen is echter niet goed bekend (Meijer, 1997). In dit opzicht is het idee, dat gemakkelijk opkomt, dat “een versnelde autolyse voor een versnelde kaasrijping zorgt”, gevaarlijk. Als de peptidasen namelijk niet stabiel zijn, zullen de peptidasen, die als gevolg van een versnelde lysis in een vroeg stadium van de kaasrijping vrijgekomen zijn, slechts een kleine bijdrage leveren aan de vorming van de textuur en het aroma van de gerijpte kaas. Het stremsel, plasmine en het cel-gebonden protease hebben dan niet genoeg tijd gekregen om het melkeiwit af te breken tot substraat, dat geschikt is voor de hydrolyse door de peptidasen. Bovendien verhindert een tè versnelde lysis de uitgroei van de SLAB tot de gewenste aantallen. Minder SLAB betekent ook minder rijpingsenzymen (Fox et al ., 1996). Daarnaast kan het aantal aanwezige SLAB niet die hoeveelheid zuur produceren, die nodig is om de zuurtegraad voor de aanwezige enzymen optimaal te maken (Crow et al ., 1995).

Tot korte tijd geleden werd verondersteld dat de rijpinsenzymen van de LAB slechts een bijdrage aan het kaasrijpen konden hebben nadat de cellen waren gelyseerd (El Soda et al ., 1995). Chapot-chartier et al. (1994) heeft twee typen kazen onderzocht. De kazen van het ene type waren gemaakt met behulp van een sterk lytische stam, terwijl de kazen van het andere type gemaakt waren met behulp van een stam die gedurende het rijpen geen autolyse vertoonde. Toch werden de peptiden uit de kazen van het laatst genoemde type gehydrolyseerd. Dit veronderstelt dat het vrijkomen van de inhoud van de cel in de kaasmatrix niet essentieel is voor de intracellulaire enzymen om toch bij het kaasrijpen betrokken te zijn. Mogelijkerwijs verhoogt permeabilisatie van de membraan de toegankelijkheid van de substraten tot de intracellulaire enzymen.
Het is bekend dat het lyseren van de cel niet onmiddelijk door de celdood gevolgd wordt. Mogelijk kan een cel met een gehydrolyseerde celwand zich in een soort tussenfase bevinden, waarin de cel intact blijft, maar waarin de peptiden uit de kaasmatrix toegang hebben tot de cel dankzij een afname van de integriteit van de celmembraan. Slechts recentelijk is een methode ontwikkeld waarmee onderscheid gemaakt kan worden tussen cellen met intacte membranen en cellen met gepermeabiliseerde membranen. Vóór deze ontwikkeling werden cellen met gepermeabilisserde membranen waargenomen als cellen met intacte membranen. Recentelijk is ecter aangetoond dat eiwitten met een grootte van kleiner of gelijk aan 25 kDa door de intacte celwand van een bacterie kunnen diffunderen. Hieruit is geconcludeerd dat tévens de intracellulaire enzymen van niet-gelyseerde cellen met gepermeabiliseerde membranen een bijdrage aan het rijpen van de kaas leveren. Peptiden uit de kaasmatrix kunnen deze cellen in diffunderen en op die manier in contact komen met de intracellulaire enzymen die zelf niet in de kaasmatrix vrijkomen.
De relatieve stabiliteiten van intracellulaire enzymen die in de kaasmatrix vrijgekomen zijn en van enzymen die zich in de gepermeabiliseerde cellen bevinden, kunnen een indicatie geven over het belang van deze enzymen bij het rijpen van de kaas. Waarschijnlijk neemt de activiteit van de intracellulaire enzymen in de tijd af, nadat deze enzymen in de proteolytisch rijke kaasmatrix zijn vrijgekomen. Wanneer gevonden wordt dat de enzymen in de gepermeabiliseerde cellen relatief langer stabiel blijven dan de enzymen die in de kaasmatrix zijn uitgelekt, kan geconcludeerd worden dat de gepermeabiliseerde cellen een significante rol hebben bij het ontstaan van het aroma van de kaas. In dat geval dienen de criteria, die gebruikt worden bij het selecteren van geschikte starter stammen, te worden aangepast. Er kunnen dan wellicht starter culturen worden samengesteld die de snelheid van het rijpen of de kwaliteit van de kaas verhogen (Niven and Mulholland, 1998).

Om de kosten van het rijpingsproces te drukken wordt reeds decennia lang naar methoden gezocht die dit proces kunnen versnellen. De zuivelindustrie heeft nooit toegestaan in het van buitenaf toevoegen van extra enzymen of andere stoffen tijdens het rijpen. Wellicht biedt de moderne biotechnologie nu de mogelijkheid tot de beschikbaarheid van verbeterde starter culturen: Een veel gebruikte starter stam is Lactococcus lactis. Deze stam is in staat de aanmaak en het vrijkomen van het eiwit nisine zelf te reguleren. Het eiwit vertoont een anti-microbiële werking en doodt bederf veroorzakende bacteriën. Nisine is het eerste peptide dat voor gebruik in de voedingsmiddelenindustrie als natuurlijk conserveermiddel is toegestaan. Het kan daarnaast wellicht gebruikt worden bij het ontwikkelen van Lactococcus lactis stammen die op de gewenste momenten binnen de kaasrijping kunnen lyseren: Bij concentraties die 1000 maal lager liggen dan de concentraties waarbij nisine de antimicobiële werking vertoont, bezit het peptide nog steeds het vermogen tot autoregulatie. Bovendien kunnen aan nisine andere eiwitten gekoppeld worden: Door nisine via genetische modificatie met de genen van de twee eiwitten holine en lysine te verrijken, kan nisine gebruikt worden om de celwand van LAB af te breken. Op dit moment worden methoden ontwikkeld om het expressiesysteem op het juiste moment binnen het kaasmakingsproces aan te zetten (Jaeger, de, 1998). Een gelijktijdige productie van lysine en holine is essentieel om een efficiënte lysis te bewerkstelligen, waarbij tevens het totale enzymsysteem dat voor ontbittering zorgt (namelijk aminopeptidase N) in de kaasmatrix wordt vrij gegeven (Ruyter, de, et al ., 1997).
Hoewel de maatschappij over het algemeen huiverig tegenover biotechologie staat, is er wellicht toch een toekomst voor deze toepassing weggelegd. Het hele systeem is namelijk volledig food grade, omdat alle controle-elementen afkomstig zijn van Lactococcus lactis. Deze bacterie heeft binnen de voedingsmiddelenindustrie de zogenaamde GRAS-status verkregen (Jaeger, de, 1998).

Uit dit verslag komt duidelijk naar voren dat het rijpen van kaas een zeer ingewikkeld proces is. Mede daarom is gekozen om dit proces voornamelijk vanuit de melkzuurbacteriën te bestuderen. De grote rol van de melkzuurbacteriën in dit proces is een andere reden voor deze keuze geweest.
Bij de selectie van geschikte starter stammen voor een bepaald type kaas kan rekening gehouden worden met de volgende criteria:
  • De melkzuurbacteriën moeten over dié enzymsystemen beschikken die in staat zijn om dié aminozuren vrij te maken en dié modificaties uit te voeren die leiden tot het karakteristieke aroma van de kaas. Deze enzymsystemen moeten daarnaast in staat zijn om eventueel bittere componenten om te zetten in niet-bittere eindproducten.
  • De concentraties van de enzymen binnen deze systemen dienen zodanig te zijn dat de karakteristieke textuur en geur binnen minimale tijd wordt gevormd. De locatie van de enzymen kan deze tijd ook beïnvloeden: De locaties dienen zodanig te zijn, dat gemakkelijk contact kan worden gemaakt tussen de enzymen en de potentiële substraten.
  • Het is belangrijk dat de enzymen stabiel kunnen blijven tot en met de momenten waarop ze geactiveerd moeten worden. Dit punt zal voornamelijk aandacht moeten krijgen bij het bestuderen van de rijpingsenzymen van gelyseerde cellen en spheroplasten.
  • De starters dienen een snelle zuurvorming te kunnen veroorzaken. Hiervoor moeten de starters 24 uur na het enten van de melk uitgegroeid zijn van 10E6 à 10E7 tot 10E8 à 10E9 cfu's per gram wrongel. Dit kan alleen wanneer de starters resistent zijn tegen bacteriofagen (Crow et al., 1993, Fox et al., 1996).
  • De autolyse van de celwand van de starters dient zo snel mogelijk na het bereiken van het maximale aantal starters plaats te vinden. Dit punt is natuurlijk alleen waar, indien de enzymen ook daadwerkelijk stabiel blijven.
Dit lijstje van criteria is verre van compleet. Bovendien bestaat nog geen totaalbeeld over de vraag welke zaken daadwerkelijk belangrijk zijn bij het kaasrijpen. Het kaasrijpen is niet slechts één enkel proces, maar het is een samenspel van van vele reacties en gebeurtenissen. Hoe dit samenspel precies verloopt is niet bekend. De afzonderlijke reacties volgen elkaar niet simpelweg op, maar kunnen vaak naast elkaar verlopen (Fox et al ., 1996).
Er dient dan ook nader onderzoek gedaan te worden. Dit onderzoek zal in de toekomst meer duidelijkheid moeten verschaffen over de verschillende factoren die het proces beïnvloeden en mede hun relatieve belang. Pas wanneer dit beter bekend is, kunnen serieuze methoden ontwikkeld worden, die het rijpen aanzienlijk kunnen verkorten en de kwaliteit beter kunnen waarborgen. Deze methoden kunnen betrekking hebben op de procescondities, maar kunnen tevens gecombineerd worden met het gebruik van entingsmengsels met een zo optimaal mogelijke samenstelling. Deze samenstelling kan bereikt worden door reeds bekende stammen te screenen op nauwkeurige criteria. Daarnaast kan eveneens gebruik gemaakt worden van biotechnologische technieken om van de bekende stammen zelf optimale stammen te creeëren (bijvoorbeeld via de toepassing van nisine).
Het is maar de twijfel of de wetenschap er in slaagt om hèt rijpen compleet te doorzien en hieruit de optimale technieken af te leiden, maar met verder onderzoek zal het gat tussen de methoden die op dit moment gebruikt worden en de ‘ideale' methoden wellicht weer een stukje kleiner worden.

LITERATUURVERWIJZINGEN


Baankreis, R. (1992). The role of lactococcal paptidases an cheese ripening. Ph. D. Thesis, University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands.

Crow, V.L., Coolbear, T., Holland, R., Pritchard, G.G. & Martly, F.G. (1993). Starters as Finishers: Starter Properties Relevant to Cheese Ripening. Int. Dairy Journal , 3 , 423-60.

Crow, V.L., Coolbear, T., Gopal, P.K., Martly, F.G., McKay, L.L. & Riepe, H. (1995). The Role of Autolysis of Lactic Acid Bacteria in the Ripening of Cheese. Int. Dairy Journal, 5 , 855-75.

El Soda, M., Farkeye, N., Vuillemard, J.C., Simard, R.E., Olson, N.F., El Kholy, W., Dako, E., Medrano, E., Gaber, M. & Lim, L. (1995). Autolysis of lactic acid bacteria: Impact on Flavour development in cheese. In Food Flavours: Generation, Analysis and Process Influence. Charalambous, G. (ED) . Elsevier Science, New York, 2205-23.

Fox, P.F., Wallace, J.M., Morgan, S., Lynch, C.M., Niland, E.J. & Tobin, J. (1996). Acceleration of cheese ripening. Lactic Acid Bacteria Genetics, Metabolism and Applications, 70 , 271-97.

Jaeger, de, P. (1998). Jonge kaas die proeft als oud. EOS , ..., 56-9.

Marchall, V.M.E. & Law, B.A. (1984). The physiology and Growth of Dairy Lactic-acid Bacteria. In Advances in the Microbiology and Biochemistry of Cheese and Fermented Milk. Davies F.L. and Law B.A. (ED) . Elsevier Apllied Science Publishers, London, 67-98.

Meijer, W.C. (1997). Expression and release of proteolytic enzymes of Lactococcus lactis -Ripening of UF-cheese-. Ph. D. Thesis, Agricultural University, Wageningen, The Netherlands.

Niven, G.W. & Mulholland, F. (1998). Cell membrane integrity and lysis in Lactococcus lactis : the detection of permeable cells in post-logarithmic phase cultures. The Society for Applied Microbiology , 84 , 90-6.

Ruyter, de, P.G.G.A., Kuipers, O.P., Meijer, W.C. & Vos, de, W.M. (1997). Food-grade controlled lysis of Lactococcus lactis for accelerated cheese ripening. Nature Biotechnology, 15 , 976-79.

Youssef, Y.B. (1992). Factors affecting proteolytic action of Lactococcus lactis in cheese. Ph. D. Thesis, Agricultural University, Wageningen, The Netherlands.



Food-Info.net is an initiative of Stichting Food-Info, The Netherlands

Free counters!