Hans Moes
Wageningen Universiteit
Literatuur recherche, November 2002

INHOUDSOPGAVE 1
INLEIDING 2
EIGENSCHAPPEN WAAR EEN ANTAGONIST AAN MOET VOLDOEN 2
HUIDIGE TOEPASSING VAN ANTAGONISTEN 3
WERKINGSMECHANISME 4
ANTAGONISTEN IN COMBINATIE MET EEN BESCHERMENDE ATMOSFEER 8
COMBINATIES VAN MEERDERE ANTAGONISTEN 8
CONCLUSIE 10
LITERATUURLIJST: 11

Door ziekte gaat jaarlijks een significant deel van de fruitoogst verloren. Een klein verlies kan al kostbaar zijn vanwege een geaccumuleerde waarde van het intensieve proces van telen, oogsten en bewaren. Toepassing van synthetische fungicide na de oogst is het belangrijkste wapen in de strijd tegen bederforganismen en pathogenen. Echter, pathogene micro-organismen ontwikkelen resistentie tegen deze fungiciden. Er bestaan niet veel chemische alternatieven voor deze fungiciden en de ontwikkeling van nieuwe varianten kost veel geld. Daarnaast stijgt de vraag naar onbespoten fruit (Jansiniewicz et al. 1996) en daarmee de vraag naar biologisch geteelde gewassen. De Nederlandse overheid promoot deze ontwikkeling door biologische boeren subsidies te verlenen, daarnaast worden steeds meer bestrijdingsmiddelen verboden vanwege risico's voor het milieu en de gezondheid.

Biologische schimmelbestrijding door middel van microbiële antagonisten wordt beschouwd als een goed alternatief voor het gebruik van zulke chemicaliën (Usall et al. 2000). Deze antagonisten bestaan meestal uit gisten die na de oogst op het fruitoppervlak aangebracht worden. Door verwondingen op het fruitoppervlak die tijdens en na de oogst ontstaan komen nutriënten vrij en wordt microbiële groei mogelijk. Antagonisten groeien op deze plekken sneller dan bederf veroorzakende schimmels en zorgen op deze wijze dat er geen infectie ontstaat.

De enorme diversiteit aan gewassen, pathogenen en omgevingsinvloeden maakt het moeilijk geschikte antagonisten te vinden die commercieel gebruikt kunnen worden. De ideale antagonist moet aan een groot aantal eigenschappen voldoen:
- Genetische stabiliteit.
- Een langdurige efficiëntie werking.
- Overleving bij slechte omgevingsomstandigheden.
- Werkzaam tegen een uiteenlopend aantal pathogenen en op een grote variëteit aan fruit.
- Groei op een goedkoop medium in een fermentor.
- Stabiliteit van het product tijdens opslag.
- Geen productie van secundaire metabolieten die schadelijk kunnen zijn voor mensen.
- Resistentie van de antagonist tegen fungiciden.
- Te combineren in gebruik met chemische en fysische behandelingen van het fruit zoals wassen en coaten.
(Droby en Chalutz. 1994)

De antagonisten moeten resistent zijn tegen chemische bestrijdingsmiddelen die gelijktijdig gebruikt worden. Het gebruik van de antagonist moet daarnaast implementeerbaar zijn in de bestaande productieketen, en daarom bestand zijn tegen verschillende temperaturen en atmosferische condities. De antagonist moet werkzaam zijn op verschillende soorten fruit (zie Figuur 1). Fruit wordt meestal bewaard (tot tien maanden) bij lagere temperaturen en onder verschillende gecontroleerde atmosferische omstandigheden. Veel bederf veroorzakende schimmels zijn in staat bij temperaturen beneden de 5 ºC uit te groeien waardoor groei niet voorkomen kan worden door koelen alleen (Droby en Chalutz. 1994).

Figuur 1: Antagonistische activiteit tegen B. cinerea (a) en P. expansum (b) van de gisten R. glutinis (LS-11) en C. laurentii (LS-28) op verschillende soorten fruit na 4-6 dagen bij 20°C. Voor elk soort fruit geldt dat waarden gemarkeerd met de zelfde letters statistisch niet van elkaar verschillen bij P=0.05 (kleine letters) en bij P=0.01 (hoofd letters), volgens de test van Duncan (Lima et al . 1998).

De twee belangrijkste producenten die momenteel een product op de markt hebben zijn Ecogen Inc met het product Aspire (antagonist: Candida oleophila ) en Ecoscience met het product Bio-Save (antagonist: Pseudomonas syringae ).

Citrusvruchten krijgen doorgaans een beschermende coating. Zowel het product Aspire als Bio-save raadt via de gebruiksaanwijzing aan de antagonist door middel van dippen aan te brengen voordat de coating wordt aangebracht. De antagonistsuspensie moet na aanbrenging gedroogd worden bij ongeveer 54 °C voordat de coating aangebracht kan worden.

Een percentage van de antagonisten overleeft deze behandeling niet. Ook de chemicaliën in de coating kunnen de antagonistflora beschadigen. De mate van overleving van de antagonist kan vergroot worden als het percentage alcohol in de coating lager is dan 6% en de concentratie morpholine en ammonia worden geminimaliseerd zodat de pH dicht bij een neutrale waarde blijft.

Het product Aspire blijkt beter te werken als het aan de coating wordt toegevoegd dan als het voor het coaten wordt aangebracht (zie Figuur 2). De antagonist moet voor een effectieve werking een oppervlakte dichtheid bereiken van minstens 10 4 KVE (kolonie vormende eenheden)/cm 2 . Deze populatie moet tijdens de eerste twee weken tijdens de opslag aanwezig zijn om bederf door verwondingen die tijdens en na de oogst zijn veroorzaakt te voorkomen (McGuire, 2000).

Days in cold storage	Days in cold storage

Figuur 2: Groen-schimmel-rot op grapefruit bewaard bij 13°C beïnvloed door de manier waarop de antagonist wordt aangebracht: toegevoegd aan de coating of gedompeld in een suspensie voor het coaten (gemiddelde van vier testen). Paren met dezelfde letter zijn niet significant verschillend bij P<0.05 volgens de t -test (McGuire, 2000).

Zowel Aspire als Bio-save hebben de afgelopen jaren aangetoond succesvol te zijn voor de bescherming van appels tegen bederf na de oogst (zie Figuur 3, Janisiewicz et al, 2000). Naast deze twee producten komen de afgelopen jaren steeds meer concurrenten met een product op de markt (zie Figuur 4).

Figuur 3: Appels behandeld zonder antagonist (links) en met een antagonist (rechts), (Anoniem. 2002).	Figuur 4: Verscheidene producten die momenteel verkocht worden als biopesticiden (Anoniem. 2002).

Kennis van het mechanisme van antagonisme is cruciaal voor de ontwikkeling van een succesvolle schimmelbestrijdingsstrategie. Deze informatie is essentieel voor het optimaliseren van de methode en de timing van het aanbrengen van de antagonist. Daarnaast is de kennis van het mechanisme nodig om tot een optimale samenstelling van het middel te komen, en om nieuwe beter werkende antagonisten te ontdekken. Er is nog weinig inzicht in het werkingsmechanisme van antagonisten tegen pathogene organismen. Naast de rol van antibiotica spelen factoren als nutriënt competitie, contact inhibitie en directe interactie tussen pathogeen en antagonist een rol (Droby en Chalutz. 1994).

De plekken waar het fruit verwond is zijn rijk aan nutriënten. De meeste pathogenen die na de oogst uit kunnen groeien zijn necrotroof, dat betekent dat ze bepaalde nutriënten voor ontkieming en initiatie van het pathogene proces nodig hebben (Janisiewicz et al, 2000).

Bij competitie is er een niche overlap waarbij meerdere typen micro-organismen gelijktijdig gebruik maken van dezelfde voedingsstoffen. Over het algemeen zijn gisten en bacteriën, vanwege een relatief groter oppervlak in verhouding tot de inhoud, in staat om voedingsstoffen sneller op te nemen dan schimmels.

Tijdens en na de oogst is het mogelijk dat er beschadigingen op het fruitoppervlak ontstaan. Omdat op de plaats van beschadiging veel nutriënten vrijkomen ontstaan infecties meestal op deze plekken. De antagonist dient met name hier, om competitie met het schadelijke organisme aan te gaan, goed te groeien. Daartoe moet het organisme gebruik kunnen maken van lage concentraties nutriënten zodat het een voorsprong heeft bij het ontstaan van een wond (zie Figuur 5). Daarnaast moet de antagonist beter dan de pathogeen aangepast zijn aan extreme omstandigheden wat betreft temperatuur, pH en osmotische stress.


Figuur 5: Populatie van de gisten R. glutinis (LS-11) en C. laurentii (LS-28) in oppervlakteverwondingen bij appels. De appels werden zeven dagen bewaard bij 20°C ((a) en (b)) en 60 dagen bewaard bij 4°C ((c) en (d)). De standaarddeviatie van het gemiddelde wordt in de grafieken aangegeven door de verticale balken (Lima et al, 1998).

Secretie van antibiotische stoffen is een gangbaar fenomeen in de natuur. Het is mogelijk dat de natuurlijke microbiële populatie op het oppervlak van de vrucht stoffen afscheidt die pathogenen in hun groeiremmen (zie Figuur 6).

Het is de vraag of antibiotica producerende antagonisten gebruikt moeten worden voor de biologische schimmelbestrijding. Aan de ene kant kan het gebruik van antibiotica producerende stammen in ons voedsel een negatief effect hebben op de humane weerstand tegen antibiotica, daarnaast zal het gebruik van deze organismen tot antibiotica resistentie bij de pathogene organismen kunnen leiden. Door deze resistentie zal het middel net als veel chemische bestrijdingsmiddelen snel zijn werking verliezen. Aan de andere kant is het beschermingsmechanisme met behulp van antibiotica producerende stammen waarschijnlijk het meest effectief, omdat dit mechanisme ook werkt tegen pathogene stammen die voor het aanbrengen van de antagonist al aanwezig waren.

Figuur 6: Dubbele cultuur van Alternaria sp. En Metschnikowia pulcherrima BIO126 op APPLE-substraat, geincubeerd in een petrischaal gedurende 12 dagen in het donker. Het is goed te zien dat in de buurt van de streep gist (links) het pathogene schimmelmycelium geremd wordt (Spadaro et al, 2001).

Een kritieke hoeveelheid antagonistische cellen is nodig om op de plaats van een beschadiging infectie te voorkomen. Beneden deze kritieke waarde zal een pathogeen de kans hebben uit te groeien en een infectie te veroorzaken. Indien het aanbrengen van de antagonist geschiedt nadat de pathogeen heeft kunnen uitgroeien zal een infectie moeilijk te voorkomen zijn. Het is daarom van belang dat de antagonist aanwezig is voordat beschadigingen op het fruitoppervlak kunnen optreden of in elk geval direct na de oogst omdat anders pathogenen kunnen uitgroeien (Droby en Chulitz. 1994).

Infectie treedt voornamelijk op tijdens het oogsten en verpakken. Omdat schadelijke bacteriën vooral in de wonden die hierbij ontstaan uitgroeien is het van belang dat de antagonist lang in de wonden kan overleven (Qing en shiping, 2000) Als fruit bewaard wordt kan de luchtcirculatie in opslagruimte de kans op infectie vergroten. De biologische controle moet daarom ook nog werkzaam zijn na langdurige (3/4 maanden) opslag. (McGuire, 2000) Zoals te zien is in Figuur 7 stijgt de populatie van de antagonist snel op de plaats waar een verwonding ontstaat. De gist sterft vervolgens langzaam af maar zal de kritieke grens (104 KVE/cm2) pas na ± 140 dagen bereiken.


Figuur 7: aantal KVE in appelwonden van de aangebrachte antagonist Candida sake op Golden delicious appels, geincubeerd bij 1 °C. De standaarddeviatie wordt met de verticale balken aangegeven (Vinas et al, 1997).


Figuur 8: Populatie van E. coli (O157:H7) in wonden van Golden Delicious appels beschermd met Bio-Save 110. De concentratie van P. syringae (Bio-save) was constant (2,4 x 10 8 KVE/ml) (Janisiewicz et al, 1999).

Antagonisten werken niet alleen tegen bederf veroorzakende organismen maar ook tegen pathogene organismen zoals E.coli O157:H7 (zie Figuur 8). Vooral als de antagonist de kans heeft om uit te groeien voordat E.coli wordt toegevoegd wordt E.coli in ruime mate afgedood (rechter grafieken Figuur 8).

Antagonisten in combinatie met een beschermende atmosfeer

In Figuur 9 is te zien dat de werking van een antagonist ook beïnvloed wordt door de atmosferische omstandigheden. Opnieuw blijkt het belang van de concentratie van de antagonist. Candida Sake werkt als antagonist beter bij hoge concentraties. Een verhoogde CO 2 concentratie heeft een sterke infectie remmende werking in combinatie met de antagonist C. Sake tegen Penicillium expansum .


Figuur 9: Effect van Candida sake op het percentage geïnfecteerde wonden bij Penicillium expansum op gewonde Golden Delicious appels onder drie commercieel gebruikte gecontroleerde atmosferische omstandigheden. Verschillende letters bij de zelfde atmosferische omstandigheden geven significante verschillen aan tussen gemiddelden volgens “Duncan's multiple range test (P=0.05), (Usall et al, 2000).

Biologische controle door het gebruik van verschillende soorten antagonisten tegelijk heeft voordelen (zie Figuur 10). Het werkingsspectrum wordt breder zodat het op verschillende soorten fruit met verschillende rijpheid gebruikt kan worden, het vergroot de efficiëntie en de betrouwbaarheid. Een voorbeeld is de gelijktijdige toepassing op appels van een antagonist tegen Blauw-schimmel en één tegen Grijs-schimmel. Daarnaast kunnen stoffen aan een antagonist worden toegevoegd om de werking te vergroten. De toevoeging van CaCl 2 bijvoorbeeld helpt de antagonist appels te beschermen tegen grijze schimmel, de toevoeging van nutriënten als l-asparagine en L-proline vergroot de werking van de antagonist Pseudomonas syringae op beschadigde plekken tegen blauwe schimmel (Janisiewicz, 1996).


y-as: Geinfecteerde wonden (%)
x-as: Antagonist Concentratie (%T)
Figuur 10: Percentage geïnfecteerde wonden op Golden Delicious appels beschermd door de antagonist T5-D3 (A) en T5-E2 (B) en een mengsel van beide antagonisten (AB). Besmetting met verschillende concentraties van de schimmel Penicillium expansum : A-1x10 4, B-5x10 4, C-1x10 5 en D-5x10 5 KVE/ml. De mengsels werden gemaakt door een combinatie van gelijke volumes van beide suspensies van de antagonisten. Balken met de zelfde letters zijn niet significant verschillend, volgens de “Waller-Duncan multiple range test”, K-ratio= 100. %T= percentage troebelheid (Jansiniewicz, 1996).

Er is de afgelopen jaren veel onderzoek gedaan naar de mogelijkheid om gisten te gebruiken als biologische bestrijdingsmiddelen op fruit. Naast de producten Aspire en Bio-Save die al enkele jaren worden toegepast komen steeds meer producten op de markt. Met name gisten zijn goed bruikbaar als antagonist. De meeste van deze gisten produceren geen antibiotica en komen van nature al voor op het fruitoppervlak. Er is bij het gebruik van deze gisten daarom geen risico voor de consument te verwachten. Als het gebruik van antagonisten wordt toegepast samen met andere bederf remmende methoden, zoals bewaring onder beschermende atmosfeer of als de antagonist gebruikt wordt in combinatie met een lage dosis fungicide, zijn bederf veroorzakende schimmels praktisch niet in staat om uit te groeien.

1. Anoniem 2002: www.apsnet.org/online/feature/biocontrol .
2. Droby, S., and Chalutz, E. 1994. Mode of action of biocontrol agents of postharvest diseases – Theory and Practice. L. Wilson and M. E. Wisniewski, eds. CRC Press, Boca Raton, FL.
3. Janisiewicz, W.J. 1996. Ecological diversity, niche overlap, and coexistence of antagonists used in developing mixtures for biocontrol of postharvest diseases of apples. Biological Control. 86(5): 473-479.
4. Janisiewicz, W. J., Conway, W. S., and Leverentz, B. 1999. Biological control of postharvest diseases of apple can prevent growth of Escherichia coli O157:H7 in apple wounds. Journal of Food Protection, 62(12): 1372-1375.
5. Janisiewicz, W. J., Tworkoski, T.J. and Sharer, C. 2000. Characterizing the mechanism of biological control of postharvest diseases on fruits with a simple method to study competition for nutrients. Phytopathology 90: 1196-1200.
6. Lima, G., De Curtis, F., Castoria, R. and De Cicco, V. 1998. Activity of the yeast Cryptococcus laurentii and Rhodotorula glutinis against post-harvest rots on different fruits. Biocontrol Science and Technology. 8: 257-267.
7. McGuire, R. 2000. Population dynamics of postharvest decay antagonists growing epiphytically and within wounds of grapefruit. Phytopathology 90:1217-1223.
8. Qing, F., and Shiping, T. 2000. Postharvest biological control of Rhizopus rot of nectarine fruits by Pichia membranefaciens . Plant Disease. 84 (11): 1212-1216.
9. Spadaro, D., Vola, S., Piano, S. and Gullino, L.M. 2002. Mechanisms of action and efficacy of four isolates of the yeast Metschikowia pulcherrima active against postharvest pathogens on apples. Postharvest Biology and Technology. 24: 123-134.
10. Usall, J., Teixido, N., Fons, E. and Vinas, I. 2000. Biological control of blue mould on apple by a strain of Candida sake under several controlled atmosphere conditions. International Journal of Food Microbiology. 58: 83-92.
11. Vinas, I., Usall, J., Teixido, N. and Sanchis, V. 1997. Biological control of major postharvest pathogens on apple with Candida sake . International Journal of Food Microbiology. 40: 9-16.